透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）制样流程

目的

利用TEM对细胞外囊泡结构形态形貌进行高分辨成像

仪器

透射电子显微镜

材料

细胞外囊泡样品、封口膜、三蒸水、镍网、2%多聚甲醛、2%醋酸铀

实验方法

1. 润湿：在封口膜上滴10 μl三蒸水，将镍网倒扣于液滴上方，使吸附面与三蒸水接触，润湿数秒钟，用滤纸吸去多余液体。

2. 沾染：将纯化的EVs样品稀释至1×10¹¹/ml，，在封口膜上滴加10 μl样品，将镍网倒扣于液滴上方，使吸附面与样品接触，吸附1 ~ 5 min。用滤纸吸去多余液体。

3. 漂洗：在封口膜上依次滴3滴10 μl三蒸水，将镍网（样品面朝下）依次置于三蒸水上漂洗数秒钟，滤纸吸干，重复三次。

4. 固定：2%多聚甲醛室温固定10 min，然后重复步骤（3），漂洗3次。

5. 负染：2%醋酸铀孵育1 ~ 5 min。（此步为负染，孵育时间越长，拍出来的背景越黑，并且可能把镍网上的碳膜压碎，导致无法拍照；负染时间太短，视野全白，导致样品与背景无法区分）。

6. 滤纸吸去多余液体，将镍网样品面朝上置于滤纸上晾干，存入样品盒，待检测。

注意事项

1. 样品浓度适宜：样品浓度过高，背景杂乱；样品浓度过低，镜下不易找到目标囊泡。

2. 样品吸附时间适宜：样品吸附时间过长，会有过多杂质吸附。

3. 铜网/镍网的正反面判断：常规情况下对着字母的面为正面；将铜网/镍网拿起后，对光反射，更明亮或色泽均匀的为正面（吸附面），暗淡或不均匀的为反面。做免疫电镜，推荐使用镍网（铜网可能与纳米金颗粒发生化学反应）。

4. 负染的原理：负染是使整个载网都铺上一层重金属盐，透射电子显微镜的电子无法或者很难穿透；而有样品的地方，由于样品的存在，载网此处金属盐较少，透射电子显微镜的电子可以穿透，从而显示样品的结构。因此染色后，在电镜下观察时，被观察的对象为亮的，背景为暗的。负染的试剂一般是电子密度较高的金属盐（常用的负染试剂为醋酸铀，柠檬酸钨等）。

5. 封口膜的作用：在封口膜上制样是因为封口膜的疏水性质，使样品或抗体在封口膜上不会散开，而会聚成一滴，便于操作。

6. 镍网取用小心：镊子夹镍网时候，只能夹边缘，避免夹中间的碳支持膜，以防夹碎碳支持膜。