近年来，对实体组织中EV的研究十分火热，本部分将以口腔鳞状细胞癌为例对组织中EV的分离进行介绍。实体组织中提取EV的方法主要有2种：酶消化法和组织培养法。

（一）胶原酶消化法

1. 原理：胶原酶消化细胞外基质，释放细胞间隙中的EV。

2. 试剂准备

（1）胶原酶IV：分装适当浓度胶原酶IV溶液（推荐分装浓度10 mg/ml），避免反复冻融。胶原酶IV溶液在-20 ℃下可稳定数月，4 ℃条件下稳定1周。推荐浓度1 mg/ml~2 mg/ml用于人头颈部鳞状细胞癌组织解离。如需无菌处理，分装前应将胶原酶IV使用0.22 μm滤器过滤。

（2）DNase I：分装适当浓度DNase I溶液，避免反复冻融，该溶液在-20 ℃可稳定9个月。建议工作浓度为0.1 mg/ml-0.2 mg/ml，防止消化液黏稠，预防EV聚集。

（3）制备含有用RPMI 1640稀释的胶原酶IV和DNA酶I的组织解离溶液，放在冰上或4 ℃备用。

3. 分离步骤

（1）将组织样品放入含HBSS、RPMI 1640或生理盐水的离心管中，冰上转移至实验室；

（2）用预冷的PBS洗涤以除去血液；

（3）在装有RPMI 1640的6 cm培养皿中，从样品中剔除坏死组织和脂肪组织，并切取肿瘤组织约黄豆大小（100 mg左右）；

（4）用预冷的PBS洗涤肿瘤组织，并用无菌纱布吸干肿瘤组织表面水分并使用精密天平记录重量；

（5）在1.5 ml EP管中加入2滴RPMI-1640，用显微剪刀在EP管中将肿瘤组织剪成小于1 mm的小块，如图1所示；（注：组织剪得越碎越好；不推荐研磨或匀浆机等存在挤压力的处理方式，因为研磨和匀浆会造成大量细胞损伤和破裂）

图1 剪碎组织

（6）将EP管内碎组织和溶液转移至6孔板或12孔板中，并加入消化液1.5 ml-2 ml（含胶原酶IV和DNase I），在37 ℃振荡培养箱中孵育1 h，500 rpm，消化前后对比如图2所示；（注：振荡培养箱转动速度可适当提高，确保液体不被摇出即可；也可将孔板放于普通培养箱中，每隔15 min轻轻摇晃数次）

图2 胶原酶IV消化前后对比（左：消化前，右：消化后）

（7）70 μm尼龙网或滤器过滤消化液；

（8）将过滤后的消化液以300 × g，10 min，4 ℃离心，获得细胞；（注：对细胞进行台盼蓝染色可检验胶原酶消化对细胞活性的影响）

（9）取上清，2,000 × g，20 min，4 ℃，弃沉淀（胶原酶IV颗粒、细胞碎片等）；

（10）10,000 × g，45 min，4 ℃，弃沉淀（进一步去除胶原酶IV颗粒和大EV）；

（11）120,000 × g，70 min，4 ℃，100 μl PBS重悬沉淀（沉淀如图3示），根据BCA或NTA的结果分装后于-80 ℃保存。

图3 EV沉淀

4. 优缺点

（1）优点：相较于组织培养法，胶原酶消化法耗时较短，且分离得到的EV更能代表组织间隙中的EV。

（2）缺点：胶原酶的使用，会引入非囊泡的酶颗粒，降低获得EV的纯度。

（二）组织培养法

1. 原理：剪碎的组织会缓慢向细胞培养基中释放EV，细胞在培养过程中也会分泌EV。

2. 分离步骤

（1）-（4）组织样品处理同胶原酶消化法；

（5）在6孔板中，用剪刀将肿瘤组织剪成1 mm~2 mm小块（<10块/孔），注意剪碎过程中保持组织湿润；

（6）如果条件允许，可让组织块贴在皿数分钟，然后沿皿壁缓慢加入RPIM-1640，避免吹起组织块，并没过组织块；

（7）转移至37 ℃，5% CO2培养箱中，培养16-18 h；

（8）收集培养液，如组织块需要继续培养，应注意小心收集培养液，减少组织块脱落；（注：如需长期培养组织块，应考虑将Exosome-free 血清和其他必需生长因子添加到培养基中）

（9）离心培养液300 × g 10 min，4 ℃，将上清液转移到新管中；

（10）取上清，2,000 × g，20 min，4 ℃，弃沉淀，取上清；

（11）10,000 × g，45 min，4 ℃，弃沉淀（进一步去除大EV）；

（12）120,000 × g，70 min，4 ℃，100 μl PBS重悬沉淀，根据BCA或NTA的结果分装后于-80 ℃保存。

注意：根据许多因素，组织体外培养活力会有所不同，例如手术方法，培养时间和组织成分。鉴于组织样本的复杂性以及与细胞系相比存在大量碎片，务必执行上述三个超速离心前步骤（300 × g、2,000 × g和10,000 × g）以去除不溶性物质，并可根据实际情况添加过滤或其他纯化步骤。

3. 优缺点

（1）优点：经济实惠，避免了酶消化过程对细胞的影响；

（2）缺点：耗时较长，提取得到的EV为细胞间隙EV和细胞在体外环境培养过程中分泌的EV。